aħbarijiet

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) huwa analogu tas-sottostrat β-galactosidase, li huwa induċibbli ħafna.Taħt l-induzzjoni ta 'IPTG, l-induttur jista' jifforma kumpless mal-proteina repressor , Sabiex il-konformazzjoni tal-proteina repressor tinbidel, sabiex ma tkunx ikkombinata mal-ġene fil-mira, u l-ġene fil-mira jiġi espress b'mod effiċjenti.Allura kif għandha tiġi ddeterminata l-konċentrazzjoni ta 'IPTG matul l-esperiment?Huwa l-akbar l-aħjar?
L-ewwel, ejja nifhmu l-prinċipju ta 'induzzjoni IPTG: l-operon tal-lattożju ta' E. coli (element) fih tliet ġeni strutturali, Z, Y, u A, li jikkodifikaw β-galactosidase, permease, u acetyltransferase, rispettivament.lacZ idrolizza l-lattożju fi glukożju u galattożju, jew f'allo-lattożju;lacY jippermetti li l-lattożju fl-ambjent jgħaddi mill-membrana taċ-ċellula u jidħol fiċ-ċellula;lacA jittrasferixxi l-grupp acetyl minn acetyl-CoA għal β-galactoside, li jinvolvi t-tneħħija tal-effett Tossiku.Barra minn hekk, hemm sekwenza operattiva O, sekwenza tal-bidu P u ġene regolatorju I. Il-kodiċi tal-ġene I hija proteina repressuri li tista 'tirrab mal-pożizzjoni O tas-sekwenza tal-operatur, sabiex l-operon (meta) jiġi ripressi u mitfija.Hemm ukoll sit ta 'rbit għal sit ta' rabta proteina-CAP attivatur tal-ġeni kataboliku 'l fuq mis-sekwenza tal-bidu P. Is-sekwenza P, is-sekwenza O u s-sit ta' rbit CAP flimkien jikkostitwixxu r-reġjun regolatorju tal-operon lac.Il-ġeni tal-kodifikazzjoni tat-tliet enzimi huma regolati mill-istess reġjun regolatorju biex tinkiseb l-espressjoni kkoordinata tal-prodotti tal-ġeni.

Fin-nuqqas ta 'lattosju, l-operon lac (meta) jinsab fi stat ta' ripressjoni.F'dan iż-żmien, ir-ripressatur tal-lac espress mis-sekwenza I taħt il-kontroll tas-sekwenza tal-promotur PI jeħel mas-sekwenza O, li jipprevjeni li l-RNA polymerase jorbot mas-sekwenza P u jinibixxi l-bidu tat-traskrizzjoni;meta l-lattożju huwa preżenti, l-operon tal-lac (meta) jista 'jiġi indott F'din is-sistema tal-operon (meta), l-induttur reali mhuwiex il-lattożju nnifsu.Il-lattożju jidħol fiċ-ċellula u jiġi katalizzat minn β-galactosidase biex jiġi kkonvertit f'allolactose.Din tal-aħħar, bħala molekula induttriċi, tingħaqad mal-proteina repressuri u tibdel il-konformazzjoni tal-proteina, li twassal għad-dissoċjazzjoni tal-proteina repressuri mis-sekwenza O u t-traskrizzjoni.Isopropylthiogalactoside (IPTG) għandu l-istess effett bħall-allolactose.Huwa induttur qawwi ħafna, li mhuwiex metabolizzat minn batterji u huwa stabbli ħafna, għalhekk huwa użat ħafna fil-laboratorji.

Kif tiddetermina l-aħjar konċentrazzjoni ta 'IPTG?Ħu E. coli bħala eżempju.
Ir-razza E. coli BL21 maħduma ġenetikament li fiha l-pGEX rikombinanti pożittiv (CGRP/msCT) ġiet imlaqqma f'mezz likwidu LB li fih 50μg · mL-1 Amp, u kkultivata matul il-lejl f'37 ° C.Il-kultura ta 'hawn fuq ġiet imlaqqma f'10 fliexken ta' 50mL medju likwidu LB frisk li fih 50μg · mL-1 Amp fi proporzjon ta '1:100 għall-kultura ta' espansjoni, u meta l-valur OD600 kien 0.6 ~ 0.8, IPTG ġie miżjud mal-konċentrazzjoni finali.Huwa 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.Wara l-induzzjoni fl-istess temperatura u l-istess ħin, ittieħdet 1 mL tas-soluzzjoni batterika minnha, u ċ-ċelloli batteriċi nġabru permezz ta 'ċentrifugazzjoni u ġew soġġetti għal SDS-PAGE biex tanalizza l-influwenza ta' konċentrazzjonijiet IPTG differenti fuq l-espressjoni tal-proteini, u mbagħad agħżel il-konċentrazzjoni IPTG bl-akbar espressjoni tal-proteina.
Wara l-esperimenti, jinstab li l-konċentrazzjoni ta 'IPTG mhix kbira kemm jista' jkun.Dan għaliex IPTG għandu ċerta tossiċità għall-batterja.Li taqbeż il-konċentrazzjoni toqtol ukoll iċ-ċellula;u b'mod ġenerali, nittamaw li l-aktar proteina solubbli espressa fiċ-ċellula, l-aħjar, iżda f'ħafna każijiet meta l-konċentrazzjoni ta 'IPTG tkun għolja wisq, se jiġi ffurmat ammont kbir ta' inklużjoni.Korp, iżda l-ammont ta 'proteina solubbli naqas.Għalhekk, l-aktar konċentrazzjoni IPTG adattata ħafna drabi ma tkunx akbar l-aħjar, iżda inqas tkun il-konċentrazzjoni.
L-għan tal-induzzjoni u l-kultivazzjoni ta 'razez ta' inġinerija ġenetika huwa li tiżdied ir-rendiment tal-proteina fil-mira u jitnaqqsu l-ispejjeż.L-espressjoni tal-ġene fil-mira mhix affettwata biss mill-fatturi tar-razza stess u l-plasmid tal-espressjoni, iżda wkoll minn kundizzjonijiet esterni oħra, bħall-konċentrazzjoni tal-induttur, it-temperatura tal-induzzjoni u l-ħin tal-induzzjoni.Għalhekk, b'mod ġenerali, qabel ma proteina mhux magħrufa tiġi espressa u purifikata, huwa aħjar li tistudja l-ħin tal-induzzjoni, it-temperatura u l-konċentrazzjoni tal-IPTG sabiex tagħżel il-kundizzjonijiet xierqa u tikseb l-aħjar riżultati sperimentali.